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一种提纯酶催化烟酰胺单核苷酸(NMN)粗品的方法

发布时间:2020-09-04

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烟酰胺单核苷酸(NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质,是辅酶I的合成底物,它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即变成辅酶I(NAD)。在生物体内NMN的水平和烟酰胺核苷酸腺苷转移酶(NMMPT)的活性直接影响到NAD的浓度,同时,NMN直接参与体内腺苷转移,是体内重要的一种合成底物和功能调节物质。在治疗应用方面,NMN可用于抗衰老、治疗慢性病等,同时研究表明NMN还对胰岛素的分泌起到调节作用,,对mRNA表达水平也有影响。因此,NMN在医药治疗方面有着普遍的应用前景,同时也作为一种反应底物在化工方面有着普遍的市场前景。

目前,烟酰胺单核苷酸的制备方法主要包括以下三种:1、酵母菌发酵法;2、化学合成法;3、生物催化法。其中化学合成法成本较高而且会产生手性化合物;酵母菌发酵法生产的NMN含有一定的溶剂残留;生物催化法不含溶剂残留,也不存在手性问题,是目前绿色环保没有公害的制备方法。

现有制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5-磷酸核糖-1-α-焦磷酸(PRPP)为底物,在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)的催化下制备NMN。此方法制得的NMN粗品用离子交换树脂进行纯化,但由于NMN与多种类似物质带电荷和极性极为相近,导致分离提纯有很大的困难,往往无法将其中的类似物杂质完全去除。现有应用离子交换树脂进行纯化的方法往往只能获得纯度60%的产品,收率在40%左右,生产效率低,成本高,不适合规模化生产。

我们使用的纯化方法步骤如下:

1、首先调粗品的PH值至5.5-6.5,然后将生物催化法制备的烟酰胺单核苷酸粗产物上含有叔基的弱碱性阴离子交换树脂柱,用水洗脱,收集洗脱液。核酸蛋白检测仪控制洗脱进程,读数上升开始收集,待到读数下降停止收集。

2、洗脱液经过纳滤浓缩/反渗透浓缩,脱除部分盐,收集洗脱液。

3、浓缩液上螯合树脂柱,用水洗脱,收集洗脱液。核酸蛋白检测仪控制洗脱进程,读数上升开始收集,待到读数下降停止收集。

 

4、洗脱液ph值调至2.0-2.4,洗脱液浓缩,使得Na离子含量在1%以下,干燥处理(冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥的一种)即得纯化后的烟酰胺单核苷酸精品。

此方法收率为60%以上,NMN的纯度到达97%以上。并且此方法绿色环保,工艺简单容易操作,生产成本低。